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Jackson手把手教你如何選擇合適的二抗
發(fā)布時(shí)間: 2020-4-17 14:08:35

什么是二抗?

二抗是在其它宿主體內制備的能與一抗或一抗片段結合的抗體,上面通常連有酶或熒光素等標簽。由于二抗所具備的優(yōu)點(diǎn)使得其在免疫學(xué)實(shí)驗中得以應用廣泛,如western blot(通過(guò)與特異性抗體結合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)),ELISA(以耦聯(lián)有酶的抗體或抗原為標記來(lái)檢測特異性的蛋白質(zhì),尤其是相應的抗原或抗體),免疫組織化學(xué)(檢測組織中的特異性抗原),免疫細胞化學(xué)(通過(guò)免疫學(xué)方法檢測細胞的抗原組成),流式細胞術(shù)(通過(guò)檢測激光所激發(fā)熒光來(lái)鑒定分離不同類(lèi)型的細胞)及免疫沉淀(通過(guò)抗原與抗體的特異性結合作用來(lái)分離相應抗原)。

使用二抗的優(yōu)勢?

二抗針對某一特定物種(如小鼠)的所有抗體均具有特異性,因而使用標記的二抗可以免去對每一個(gè)一抗進(jìn)行標記,大大節省了時(shí)間和費用;此外,一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結合幾個(gè)二抗分子,從而使信號大大增強,提高了實(shí)驗靈敏度。二抗可以耦聯(lián)有幾種不同的標記,可以是酶,熒光素,或生物素。

如何選擇二抗?

檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇,同時(shí)在后繼試驗中也會(huì )有不同的檢測方案,因此在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類(lèi)型及后繼檢測方案的要求,其中如何根據一抗的種屬來(lái)源和類(lèi)型選擇二抗尤為重要。小編根據以往的經(jīng)驗整理了一下選擇的要點(diǎn):

1. 一抗的種屬來(lái)源

二抗應選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源,例如:如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體,二抗則選抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體,則相應的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據一抗的物種來(lái)源選擇相應的抗該物種的二抗。

2. 一抗是屬于哪個(gè)類(lèi)或亞類(lèi)

除了要與一抗的種屬來(lái)源相一致,二抗還需與一抗的類(lèi)別或亞類(lèi)相匹配,這通常是針對單克隆抗體而言。一般來(lái)說(shuō)多克隆抗體主要是IgG類(lèi)免疫球蛋白,因此相應的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對復雜些,由于單克隆抗體有不同的類(lèi)別和亞型,因此相應的二抗也需要根據這些亞型進(jìn)行選擇。

單克隆抗體的類(lèi)別及亞類(lèi)通常會(huì )在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中都會(huì )有描述,如果您的一抗是小鼠IgM,那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠 IgG的某一亞類(lèi)(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合,或者您也可以選擇專(zhuān)門(mén)針對這一亞類(lèi)的二抗,例如,如果您的一抗是小鼠IgG1,那么您可以選擇抗IgG1的二抗,此種抗體在雙標記實(shí)驗中尤其適合。在不清楚一抗為何種類(lèi)/亞類(lèi)的情況下,可以選用抗相應物種IgG,因為此種抗體可以識別大多數類(lèi)型的IgG免疫球蛋白。

3. 二抗的種屬來(lái)源

一般來(lái)說(shuō),不同的種屬來(lái)源與二抗的質(zhì)量沒(méi)有必然的聯(lián)系,來(lái)源于山羊的二抗與來(lái)源于驢的二抗在一般的實(shí)驗里沒(méi)有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗里,如雙標實(shí)驗里,如果其中一個(gè)一抗是山羊來(lái)源的,一個(gè)是小鼠來(lái)源的,則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗,這時(shí)候,二抗就不能選擇山羊或者小鼠來(lái)源的。選擇相應的驢來(lái)源的二抗,就非常適合做類(lèi)似雙標的免疫實(shí)驗。雙標得2個(gè)都抗才行,故選擇第3個(gè)種源的抗體

4. 選擇哪種形式的二抗,是整個(gè)IgG分子,F(ab')2片段,還是Fab片段?

整個(gè)IgG分子:此種抗體適用于多數情況。

F(ab')2片段:該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結合抗原的Fab片段組成, 這些抗體用在特定的情況中,如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況。

Fab片段:它們只有一個(gè)結合位點(diǎn),一般用來(lái)封閉內源性免疫球蛋白。

5. 二抗的耦聯(lián)標記

 一般來(lái)講,耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶,熒光基團(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗。對于western blotELISA,最常用的二抗是酶標二抗,而細胞或組織標記實(shí)驗(細胞免疫化學(xué),組織免疫化學(xué),流式細胞術(shù))中通常使用熒光基團標記的二抗,免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號,可以使用biotin/avidin檢測系統。在一些熒光檢測方案中,則需要選擇不同的熒光標記;而金顆粒標記的二抗則更多的應用于免疫電鏡中。

6. 抗體的純度

親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎,因為這些產(chǎn)品的純度最高,產(chǎn)生的非特異性背景最少。但是有些情況下也要考慮到純化過(guò)程中損失的IgG部分,因為其中含有親和力很高的抗體,尤其是當目的抗原存在的量很小的時(shí)候,高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。

下面總結了幾種具有不同特異性的二抗

1)針對整個(gè)抗體分子(HL)具有特異性:

anti-IgG(H+L),此類(lèi)抗體既可以與抗體的重鏈結合也可以與輕鏈結合,即與抗體分子的Fc,F(ab')2/Fab部分均可反應,anti- IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(如IgMIgA),因為所有的免疫球蛋白都具有相同的輕鏈(κ鏈或λ鏈)。

2)針對Fab片段具有特異性:

這類(lèi)抗體與重鏈輕鏈均可以結合,由于它們可以與輕鏈反應,它們同時(shí)也可以和具有相同輕鏈的其他種類(lèi)的免疫球蛋白反應。

3)針對Fc片段或重鏈具有特異性:

這類(lèi)抗體和重鏈的Fc部分反應,因此它們是類(lèi)別特異性的。即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應,mu鏈特異性抗體只識別IgM,依此類(lèi)推。

4)輕鏈(lambda,kappa)特異性:

與所有類(lèi)別的抗體反應,因為所有類(lèi)別的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。

5)經(jīng)過(guò)吸附處理的二抗:

不同來(lái)源的免疫球蛋白含有相似的結構,抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應,因此有些二抗經(jīng)過(guò)了動(dòng)物或人類(lèi)IgG吸附處理,以減少非特異性背景。 例如,如果是小鼠的組織或細胞,那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過(guò)的二抗可以減少非特異性結合。但是此種抗體識別表位的數量被大大減少。


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